Экспозиция музея расположена в здании, построенном специально для музея в 1902 году по проекту Петра Станиславовича Купинского. Экспонаты объединены по темам в хронологическом порядке. Посетитель знакомится с развитием железнодорожного транспорта от зарождения железных дорог до сегодняшнего дня.
ЗАЛ №1 Первый зал посвящён зарождению железных дорог в мире и в нашей стране. Модели первых рельсов и паровозов – попытки соединить города и облегчить тяжёлую ручную работу. Обращает на себя внимание модель первого русского паровоза, построенного отцом и сыном Черепановыми в 1834 году на Урале. Но работал он на заводской дороге. А первая железная дорога общего пользования построена между Петербургом и Павловском через Царское село. Она была открыта для движения 30 октября 1837 года. Этот день и считается датой рождения железный дорог в России.
ЗАЛ №2 Зал очень актуален для нашего города, расположенного на 42 островах. Железнодорожные мосты поражают своим разнообразием: однопролётные и многопролётные; деревянные, каменные, металлические, железобетонные; однопутные, двухпутные и многопутные; с ездой поверху, понизу и посередине; балочные, арочные, рамные, висячие и вантовые. Вы увидите модели мостов талантливых инженеров Дмитрия Ивановича Журавского, Николая Аполлоновича Белелюбского, Лавра Дмитриевича Проскурякова и других. А также немного узнаете о золотой «пряжке» стального пояса Российской империи.
ЗАЛ №3 В этом зале по представленным моделям и фотографиям можно проследить развитие отечественного паровозо- и вагоностроения во времена царствования императоров. Собственное производство подвижного состава в России ведёт отсчёт с 1845 года, когда шло строительство железнодорожной магистрали между двумя столицами страны – Санкт-Петербургом и Москвой. Большой интерес представляют подлинные аппараты связи первых железных дорог страны. С их помощью соседние станции согласовывали между собой движение поездов.
ЗАЛ №4 Экспозиция зала посвящена работе железнодорожного транспорта в тяжёлые военные годы. В центре зала диорама восстанавливающейся после освобождения станции. На первом плане виден немецкий путеразрушитель системы «крюк», с помощью которого враги разрушали железные дороги. За время войны было разрушено 65 тысяч километров железнодорожных путей, более 13 тысяч искусственных сооружений, более 4 тысяч станций. Новые линии прокладывали со скоростью 16 км за день. А восстановлено было 115 тысяч километров железных дорог (некоторые дороги восстанавливались по два-три раза). Дополняют экспозицию макеты бронепоездов времён гражданской и Великой Отечественной войн и картины на тему «Железнодорожный транспорт в годы войны».
ЗАЛ №5 Для строительства железных дорог, текущего содержания и ремонта пути используются различные строительные и дорожные машины, разработанные учёными и инженерами железнодорожной отрасли. В музее представлены материалы и действующие модели, по которым можно изучить методику строительства и устройства железнодорожного полотна.
ЗАЛ №6 Действующий макет механизированной сортировочной горки изготовлен в 1935 году. Прототипом макета послужила станция Красный Лиман Донецкой ж.д. с первой механизированной горкой в стране, введённая в эксплуатацию в 1934 году. Такие станции нужны для массового формирования и расформирования грузовых поездов. На них перерабатывают транзитные и местные вагонопотоки и формируют поезда, идущие на большие расстояния в другие города. Во время экскурсии можно увидеть работу маневрового локомотива сортировочной станции и роспуск товарного состава – спуск вагонов с горки.
ЗАЛ №7 Гордость музея – коллекция предметов по теме «Локомотивостроение», в которой представлены натурные образцы, модели, чертежи, фотографии локомотивов. В ХХ веке на железных дорогах использовались различные виды тяги – работали паровозы, тепловозы и электровозы. В зале представлены модели наиболее распространенных и интересных локомотивов.
ЗАЛ №8 Коллекция моделей вагонов позволяет увидеть изменения, произошедшие в их конструкции. Вместо прежних 20-тонных двухосных вагонов-коробочек выпускаются четырёх-, шести- и восьмиосные вагоны грузоподъёмностью от 60 до 120 тонн. В зале представлены модели различных специализированных вагонов: вагоны ледники с потолочными и боковыми карманами для льда, вагоны для перевозки живой рыбы, вагоны-самосвалы, цистерны для перевозки жидких веществ (молока, бензина, нефти)
ЗАЛ №9 Работу дежурных по станции и диспетчера по приёму и отправлению поездов можно увидеть в последнем зале. Здесь находится макет электрифицированного участка железной дороги, управление движением поездов на котором осуществляется с подлинных пультов ДЦ, МРЦ, ЭЦ, МКУ. Макет с четырьмя станциями и электропоездами выполнен в масштабе 1:50, имеет длину 43 метра.
ЗАЛ №10 Интерактивный зал истории Санкт-Петербургского метрополитена вовлекает посетителя в рабочие процессы современной подземной городской железной дороги с помощи звуковых и световых эффектов, диорам, мультимедийных панелей.